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【First-in-class药设系列】调控Notch信号通路的生物大分子设计
来源: | 作者:佚名 | 发布时间: 2023-03-27 | 113 次浏览 | 分享到:

Notch通路是广泛存在的细胞基本通路之一,在细胞命运决定等生物过程中发挥重要作用。Notch 信号转导在多细胞生物中是一条进化上非常保守的通路,可在发育过程中调控细胞命运决定并维持成人组织的稳态。Notch 受体为单一跨膜蛋白,由功能性胞外 (Notch extracellular domain, NECD)、跨膜 (Transmembrane, TM) 和胞内 (Notch intracellular domain, NICD) 结构域组成。Delta-like(DLL1、DLL3、DLL4)和 Jagged(JAG1、JAG2)家族成员可作为 Notch 信号转导受体的配体。在接收到配体信号之后,会通过相关酶的剪切作用,分别去除Notch胞外和胞内结构域,并进一步激活下游信号通路。前期研究发现, Notch 受体激活性突变可导致Notch胞内结构域在细胞核内的聚积,这在白血病和淋巴瘤中非常常见。此外,一些病症还与 Notch 受体和配体的功能缺失突变有关。

对于天然Notch配体的重组是非常有吸引力的调节Notch信号的方式,但是天然配体与受体具有较低的亲和力,这限制了它们在生物医学中的应用。为了克服这一点,来自美国Moffitt癌症中心的研究者通过定向进化Notch的其中一个配体DLL4,最终得到高亲和力分子Delta-MAX,可用于Notch相关细胞通路的研究,也可以做为一种广谱激活或抑制Notch信号的生物大分子进一步开展创新药物开发。

研究人员在前期的工作曾利用酵母表面展示技术对Notch配体DLL4和Jagged1进行过定向进化的尝试。在此基础上,研究者着手对DLL4变体进行亲和力的进一步优化。首先,他们通过docking方式和展示技术,寻找对DLL4亲和力有重要贡献的残基,发现了9个DLL4残基(H256, N257, T271, L279, F280, T289, S301, N302, Q305)有可能发挥功能。通过多轮的组合筛选后,发现DLL4中的N257P、T271L、F280Y、S301R和Q305P这5个突变对亲和力增强的比例较高。

继而,他们将之前发现的大鼠DLL4变体(E12)中的5个亲和增强突变(G28S, F107L, I143F, H194Y和L206P)也移植到人DLL4,设计了一个具有最大受体亲和力的DLL4变体蛋白Delta-MAX,共包含10个突变:G28S、F107L、I143F、H194Y、L206P、N257P、T271L、F280Y、S301R和Q305P。生化实验表明,Delta-MAX表现出增强的亲和力、稳定性和表达,同时对不同Notch受体保持广泛的反应性。为了探究Delta-MAX对Notch的调节能力,通过荧光Notch1报告细胞发现Delta-MAX对Notch1激活的EC50分别为0.009 ng/mm^2,相比野生型(WT)DLL4对Notch激活效率提高了250倍,且Delta-MAX诱导的Emax比WT DLL4诱导的Emax大20%。

为了确定Delta-MAX是否会刺激表达内源性Notch1水平的细胞激活增加,研究人员比较了Delta-MAX和WT DLL4在U2OS(骨肉瘤)和MCF-7(乳腺癌)细胞中的信号通路,发现Delta-MAX在两种细胞系中都比WT DLL4更有效地激活Notch信号,这表明无论Notch表达水平如何,Delta-MAX都是一种更有效的激动剂。进一步,他们用五种不同的形式来评估Delta-MAX的效果,挑选最佳给药策略,分别是:Notch1报告细胞与酵母展示的Delta-MAX,293T细胞表达的Delta-MAX,微珠包被的Delta-MAX,以及包被培养板(包括非特异性吸附和C端生物素化偶联的Delta-MAX)。数据显示,重组蛋白形式(板或珠结合配体)诱导的信号水平高于基于细胞的方法,C端锚定的Delta-MAX的Emax增加表明这是最大化Notch刺激的理想选择。

值得注意的是,在没有膜锚的情况下,可溶性Delta-MAX表现为泛Notch抑制剂,IC 50为 0.6 nM,甚至比现有的小分子 Notch 抑制剂都要强(例如DAPT 和BB-94),比 DAPT(IC 50为 40 nM)强 40 倍,比 BB-94(IC 50为 1,000 nM)强 1,000 倍。进而,他们还测试了可溶性Delta-MAX抑制除DLL4外配体信号的能力,发现DeltaMAX对DLL1、DLL4、JAG1和JAG2的信号通路有很强的抑制作用。

Notch信号通路有助于维持未分化的神经祖细胞处于增殖状态,因此Notch抑制会使神经祖细胞分化为神经元。在没有Notch抑制的情况下,神经祖细胞标记物SOX2正常表达。可溶性Delta-MAX以浓度依赖的方式增强了大脑皮层神经元的分化:它抑制了SOX2,并急剧增加泛神经元标记物(MAPT, SNAP25, DCX)、谷氨酸标记物(VGLUT2)和大脑皮层神经元标记物(TBR1)。可溶性Delta-MAX (1 μM)在诱导神经元分化方面与10 μM DAPT相当,但后者不优于前者。此外,可溶性WT DLL4不能上调神经元标记物或抑制神经祖细胞标记物,从而证明了可溶性Delta-MAX的优越性。总之,可溶性Delta-MAX是一种有效的Notch通路拮抗剂,可驱动神经祖细胞分化为神经元。


综上,重组DLL或JAG ECD与Notch受体结合较弱,是Notch信号的低效调节剂。研究人员设计了合成的Delta-MAX生物大分子,使其成为激活或抑制哺乳动物Notch受体的多功能工具(锚定为激动/可溶为抑制)。与WT DLL4相比,固定化或细胞的Delta-MAX表现出不同程度的信号效力增强;当作为可溶性诱饵使用时,可溶性Delta-MAX可作为Notch特异性抑制剂,且Delta-MAX增加的热稳定性和表达产量是对未来的蛋白质生物制剂生产也是一个有利的特性。


来源:分子设计