细胞外囊泡（EV）由于其结构、组成以及在再生和免疫调节方面的独特性，作为传递载体引起了人们的关注。然而，EV的产生和存储困难限制了其大规模临床应用。通过自上而下的策略制备的细胞外囊泡模拟物（EVM）可提高纳米颗粒的产率，同时保留与EVs相似的生物学特性，用于解决这些局限性。在此，浙大骨科林贤丰总结了EVMs的制备、结构、组成、靶向能力、细胞摄取机制和免疫原性方面的特点，以及作为EV替代品的优势、局限性和未来临床应用前景。相关论文“Extracellular vesicle mimetics: preparation from top-down approaches and biological functions”于2022年7月28日发表在杂志《Adv. Healthcare Mater.》上。

1. EVM的制备方法

EVM的制备大致分为三类：（1）从完整细胞制备，通过膜过滤器挤出是最常用的方法，为了提高产量还可在传统挤压方法之前引入冻融程序来优化制造方法。（2）使用去除细胞质和细胞核后留下的细胞膜通过低渗处理、均质、超声和纯化步骤制备，可以装载更多的外源物质，用作优秀的药物传递系统。（3）使用EVs和脂质体制备混合EVM，采用冻融、共挤和直接孵化进行制备，具有增强的药物传递能力和穿透大肿瘤结节的能力（图1）。

图1. 细胞外囊泡模拟物(EVMs)的制备方法

2. EVM的改造方法

包括直接改造法和从改良细胞中制备EVMs，在直接改造法中，制备的EVM可与药物直接共孵育或超声处理可用于药物装载，或通过电穿孔加载siRNA来完成。而在改造细胞中，可通过将需要负载的药物与细胞共同孵育之后制备EVMs，对于RNA修饰，首先用过表达的长非编码RNA（lncRNA）质粒，或短发夹RNA（shRNA）转染细胞，然后使用这些修饰的细胞制备EVM（图2）。

图2. EVMs的修饰方法

3.EVMs 和 EVs之间的产量比较

EVMs的产量远远高于传统方法生产的EVs。通常，基于膜过滤挤出的方法产生的EVMs比EVs多100-200倍，而化学诱导的细胞起泡产生的细胞外气泡大约多10倍，杂交EVMs的产量也增加了10-40倍。EVMs的制备也大大减少了生产所需的时间，典型EV的制备时间为3天，而几种常用的EVMs制备方法可以将时间减少到1天以下。

4. EVMs 的结构和组成

透射电子显微镜（TEM）图像显示EVM是由脂质双层包裹的球形膜泡，尺寸在50-150nm之间，与EVs共享多个细胞膜表面标记，例如CD63、CD81、和TSG101，有学者发现MSC和EVM的RNA表达谱几乎相同，有望取代亲本细胞并发挥独特的生物学作用（图3）。

图3 EVMs的结构和组成

5. EVMs 的表征和检测技术

EVM体积很小，包含复杂的生物成分，这阻碍了其准确检测和表征。在常用的确定EVMs粒径的方法中，纳米颗粒跟踪分析（NTA）可以确定细胞囊泡的大小和浓度，并同时分析多个囊泡。可调谐电阻脉冲传感（TRPS）可用于测量EVM的尺寸，冷冻透射电子显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜是EVM形态表征的常用技术，酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹、液相色谱和质谱通常用于蛋白质检测，同时，新技术已逐渐应用于EVMs的成分检测领域，如表面等离子体生物传感器、微流控芯片技术和电化学技术，以实现EVMs的高通量、高灵敏度和实时定量检测。

6. EVMs 的靶向和细胞摄取

EVMs和EVs以相似的方式靶向特定细胞，EVMs渗透性增强使其能够穿过血脑屏障，并将物质运输到大脑，这种靶向能力与其表面的膜蛋白有关，如CD63。然而，EVMs的靶向能力仍然相对较低，外源性注射后EVMs主要积聚在肝脏和脾脏中。因此，提出了几种方法来增强EVMs的瞄准能力。一种方法在制备过程中保留EVM衍生细胞的蛋白质，并通过蛋白质-蛋白质相互作用实现靶向递送，第二种方法是修饰EVMs表面的化合物，以促进配体介导的靶向。此外，EVM的靶向能力可以通过负载磁性物质来增强（图4）。

图4 增强EVMs靶向能力的方法

关于EVMs的摄取可以通过用DiD（一种亲脂性染料）标记EVMs来检测，随后可以使用共焦显微镜进行观察。EVMs摄取的潜在机制尚不清楚，一般来说，自然分离的EVMs通过与血浆直接融合被靶细胞内化。EVMs的细胞摄取途径与EVs相似，因此，尽管不同细胞的内吞机制不同， EVMs也可被自体细胞或靶细胞内吞（图5）。

图5 EVMs的细胞摄取机制

7. EVMs 的免疫原性

与传统药物输送系统相比，这些基于细胞的输送系统除了具有受控药物释放和组织主动靶向性外，还具有更高的生物相容性、更低的毒性和更大的跨越各种生物屏障的能力。EVM具有稳定的结构，有助于某些生物活动，例如靶向特定器官或组织并将货物运送到相应的位置，并且容易被细胞吸收，因此不会在循环中长期累积。当产生EVMs时，在纯化过程中完全去除残留的细胞碎片和细胞外生物分子很重要，因为不完全的纯化可能会直接影响产品的最终免疫原性，留下蛋白质污染物。常用的纯化方法包括密度梯度超速离心和尺寸排斥色谱法（SEC），提高最终产品的纯度和收率。

8. EVMs 的应用

由于EVM是类EV纳米颗粒，它们显示出类似的生理和生化特性，例如在循环中长时间滞留而不清除，靶向组织器官具有特异性，给药效率高。因此，EVMs在肿瘤治疗、组织再生和疾病成像追踪中发挥着重要作用。此外，由于EVMs与其来源细胞之间的共性，EVMs也可以作为细胞刺激的替代品，表现出独特的功能（图6）。

图6 EVMs在肿瘤治疗、再生医学和疾病成像追踪中的应用

9. EVMs的临床应用和面临的挑战

在www.clinicaltrials上注册了300多个涉及EVs的临床试验。其中大多数侧重于EVs在疾病预测和预后方面的能力，或EVs在治疗相关疾病方面的治疗用途。例如，骨髓间充质干细胞衍生EV作为治疗药物已用于治疗Cov-19，EVs可应用于疫苗开发等。然而，作为新材料，EVs的模拟物EVMs的临床应用数据有限。已经建立了相关的动物模型，以探索EVMs在疾病诊断中的作用，包括肿瘤学、免疫调节和组织修复。然而，对于EVMs的大规模临床应用，仍有几个问题需要解决。首先，EVMs的生物学功能尚未完全确定。其次，需保证大规模生产的相应标准和监管措施，确保其安全性，必须设计一套标准化的生产、分离和净化设备，以提高和稳定生产质量。第三，仍然缺乏标准化的评估方法定量检测EVMs的理化表征。

由于EVMs的制备、表征和质量控制中存在这些尚未解决的问题，目前还没有基于EVMs的经批准的治疗方法。因此，迫切需要开发标准化的制备工艺，改进现有的表征和检测技术，并与监管机构合作，以在基于EVMs的治疗的临床应用中取得进一步进展。

10. 总结与展望

近年来，EVs相关研究已成为一个热门话题，与药物释放等治疗应用密切相关。然而，作为临床治疗剂的使用受到了重大限制，例如与临床水平的大规模生产、分离、修饰和纯化相关问题的存在，导致EVs的探索和发展受限。本文重点研究了合成的EVs模拟物，即EVMs，并描述了与其制备和修改相关的方法，以及EVs和EVMs之间的异同。一般来说，EVMs可以执行EVs的某些生物功能。此外，与EVs相比，EVMs具有许多优点：（1）制备方法简单，产率和生产效率高，（2）更方便的载药疗法，（3）与亲本细胞具有更高的相似性，这允许EVM保留原始细胞的许多特性。此外，由于其优越的产量和生产效率，EVMs显示出比EVs更广阔的应用前景，可以作为EVs的替代品。

然而，EVMs的应用仍然存在局限性。例如，EVMs的靶向性稍低，并且制备的颗粒的大小尚未均匀。同时，现有技术无法确定EVMs的具体组成，其物理化学性质的准确表征仍然具有挑战性。因此，在临床应用这种新型生物材料之前，需要进一步研究EVMs可行高效的制备方法。未来，EVMs将在纳米医学、化学工程和生物合成领域做出重大贡献。

来源：药物传递