G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)介导了人体内大部分的跨膜信号。配体通过占据GPCR使之成为典型的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)，进而激活异源三聚体G蛋白(heterotrimeric G-proteins, Gαβγ)，但也可通过GPCR不依赖的方式促进G蛋白信号传导。GIV(也称为Girdin)是一种与Gαi亚基结合的细胞质蛋白，是第一个非受体GEF，它与Gαi亚基结合后，以一种不依赖于GPCR的方式促进G蛋白信号转导，通过释放游离Gβγ，直接激活PI3K，促进Akt磷酸化，重塑肌动蛋白细胞骨架，并调节细胞迁移。其与各种类型的癌症向更具侵袭性和转移性的、阶段的进展相关。

虽然G蛋白本身有作为药理靶点的潜力，但还没有临床批准的治疗异三聚体G蛋白的药物，近日来自波士顿大学的研究团队在bioRxiv预印网站上发表文章，报道了第一个化合物IGGi-11能够特异性的阻断Gαi与GIV的结合，而不会干扰G蛋白的其他功能。

首先，研究人员对从包含200,000个化合物的化合物库集合中，利用荧光偏振FP筛选出580个阳性化合物。再经FP和AlphaScreen筛选出155个均呈阳性的化合物；其中68种化合物因不良的化学性质而被丢弃，而剩余的化合物中只有69种有库存可以继续研究，将其命名为“IGGi”(为“GIV-Gαi相互作用的抑制剂”)。在基于细胞水平评价69个IGGI化合物发现，在高表达GIV的癌细胞系(例如：三阴性的转移性乳腺癌细胞系，MDA-MB-231)中，大约三分之一的IGGi化合物损害了 MDA-MB-231细胞的迁移，而不影响细胞的活力。进一步，过滤掉削弱表达低水平GIV的非转移性乳腺癌细胞株MCF-7细胞或未转化的乳腺上皮细胞MCF-10A的活性的化合物，以排除非特异性细胞毒性的分子，最终获得化合物IGGi-11能抑制Gαi3与GIV的结合。

为了探究IGGi-11是否与Gαi的结合，利用核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)波谱，研究人员发现IGGi-11在同位素标记的(2H-13C-15N) Gαi离散氨基酸的酰胺键信号中会引起剂量依赖的化学位移扰动(chemical shift perturbations, CSP)，表明该化合物与Gαi结合。利用突变体和等温滴定量热(isothermal titration calorimetry, ITC)实验，表明IGGi-11以低微摩尔亲和力结合到Gαi蛋白的GIV相互作用位点，从而在体外阻断了GIV-Gαi复合物的形成。

为了揭示特异性阻断GIV-Gαi复合物是否会影响G蛋白的正常的功能和活性，研究人员使用生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)检测了IGGi-11对Gβγ与Gα的关联的影响，发现浓度高达100 μM的IGGi-11不会导致Gβγ从Gαi中分离，表明IGGi-11不会破坏Gαβγ异源三聚体。

进而，研究人员评估了IGGi-11对GPCR激活的G蛋白的影响，发现即使在高达100μM的IGGi-11浓度也不会干扰激动剂刺激的GPCRs激活G蛋白的能力。快速动力学分析进一步证实，IGGi-11不会改变GPCR激活后Gβγ的解离速率或Gβγ- Gαi的再结合速率，且GPCR刺激下Gαi-GTP形成的振幅和动力学都不受IGGi-11的影响。同时，在表达腺酰环化酶的细胞膜中，IGGi-11既不影响纯化的Gαs介导的腺苷酸环化酶的激活，也不影响纯化的Gαi介导的抑制。

IGGi-11预孵育MDA-MB-231细胞仅能轻微抑制其迁移能力，这可能是由于IGGi-11含有两个带负电荷的羧酸基，膜透性低所致。为了克服这一问题，研究人员假设加入酯化作用可以通过消除羧酸的电荷来增加膜的通透性，设计合成了IGGi-11me。

实验结果表明，IGGi-11me抑制迁移的能力相对于IGGi-11得到了大幅度的提升，并且两者都不会影响细胞的活性。膜透性试验证实IGGi-11me的通透性高于IGGi-11，且MDA-MB-231细胞胞浆中的酯酶可以将IGGi-11me转化为IGGi-11。这些结果表明，IGGi-11me作为前药，允许IGGi-11在细胞中起作用。

GIV可以通过激活G蛋白，产生的Gβγ激活PI3K-AKT信号通路，促进AKT的磷酸化激活。在MDA-MB-231和HeLa两种细胞系中，随着IGGi-11me浓度的提升，在EGF刺激下Akt的磷酸化出现了下降的趋势，造成Akt活性降低；同时，IGGi-11me未能进一步降低GIV缺失细胞中Akt的激活，提示IGGi-11me不影响GIV不依赖的EGFR下游Akt激活机制。此外，IGGi-11me并没有改变GIV或Gαi的总量，说明IGGi-11me的作用机制是破坏这两种蛋白质的相互作用，而不是间接改变它们的丰度。综上，这些结果表明IGGi-11me特异性地抑制癌细胞中GIV依赖的G蛋白信号。

对于GIV不依赖的G蛋白信号，研究人员用GPCR的激动剂SDF-1α刺激个细胞，发现IGGi-11me抑制了Akt对EGF的激活，但对SDF-1α没有反应，表明它不干扰GPCR介导的G蛋白信号。相反，百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)阻断了GPCRs对Gαi的激活，而不是GIV，这些结果表明IGGi-11me特异性靶向GIV依赖G蛋白信号转导机制，而不干扰典型GPCR介导的G蛋白信号转导。

易于转移的侵袭性乳腺癌(BRCA)细胞系比非侵袭性乳腺癌细胞系表达了更高水平的GIV。IGGi-11me对MDA-MB-231细胞(GIV-High)的迁移抑制作用大约是MCF-7细胞(GIV-Low)的4倍。当然，对IGGi-11me敏感性的差异不能归因于Gαi蛋白丰度的差异，因为它们在两种细胞系中都以相似的数量存在。为了进一步证实IGGi-11me特异性地抑制GIV依赖的肿瘤细胞迁移，研究人员测试了它对GIV耗尽的MDA-MB-231细胞的影响。发现与对照细胞相比，IGGi-11me对GIV耗尽后MDA MB-231细胞迁移没有影响。对HeLa细胞也进行了类似的观察，进一步支持IGGi-11me对细胞迁移的抑制是GIV依赖的。此外，IGGi-11me对细胞迁移的抑制并不是降低细胞活力的结果，在所研究的任何细胞系中，活性都不受该化合物的影响。这些发现揭示IGGi-11me特异性阻断了GIV依赖的肿瘤细胞迁移，也意味着GIV-Gαi复合物的破坏，会削弱高表达GIV的癌细胞的侵袭能力。

IGGi-11me会降低小鼠皮下移植MDA-MB-231细胞形成肿瘤的能力。由于无法观察到皮下肿瘤植入时肺部的转移性侵袭，转而评估了IGGi-11me对通过尾静脉注射MDA-MB-231细胞的影响，发现IGGi-11me降低了尾静脉注射几周后MDA-MB-231细胞出现在肺部的能力，表明通过IGGi-11me破坏GIV-Gαi相互作用可以阻止癌细胞的迁移和生长。

 综上，本工作筛选出的IGGi-11特异性地阻断与Gαi与GIV的结合，而不影响G蛋白的其他功能,用作G蛋白介导的非典型细胞信号机制的化学探针，IGGi-11可以进一步作为先导化合物，以开发具有更好效力和药代动力学特性的类似物，从而具有治疗价值。

 来源：分子设计